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        SMN1基因外显子缺失检测试(shì)剂(jì)产品审评现状

        发布(bù)时(shí)间(jiān):2018-10-24
        浏览次数:6548

               脊髓性肌萎缩症(zhèng)(spinalmuscularatrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗(yí)传病,居儿童致死性常染色体隐(yǐn)性遗传病的第2位(wèi)。位于染色体5q11.2~q13.3上的(de)运动神经元存活基因(Survivalmotorneuron,SMN)是SMA的主要致(zhì)病基因。

          人(rén)基因组有两个紧邻的高(gāo)度同源的SMN基因:端粒侧的SMN1和着丝粒侧(cè)的SMN2,两者仅有5个碱基不(bú)同。SMN1是主要功能基因,该(gāi)基因突(tū)变可导致SMA发(fā)病,SMN2为临床表型的(de)调(diào)节基因,影响病情(qíng)的严重程(chéng)度(dù),其(qí)拷贝数增(zēng)加可(kě)减轻SMA表型。目前已(yǐ)知约94%的SMA患者为(wéi)SMN1基(jī)因第7和(hé)(或)第8外显子纯合缺(quē)失所致(zhì),少数(shù)病例(lì)可由SMN1基因点突变或小的缺失引起。

          SMN1基因外显子缺失检测的意义

          SMA在(zài)人群中的发病率为(wéi)1/5000~1/10000,群体携带者频率为1/35~1/50,是出生缺陷的高危因素,因此极有必要进(jìn)行(háng)SMA携带者(zhě)的人(rén)群筛查,并通过(guò)产(chǎn)前诊断技(jì)术降低人群中(zhōng)SMA患儿的出生率。

          临床上将SMA分为Ⅰ、Ⅱ和(hé)Ⅲ型,即(jí)婴儿型(xíng)、中间型和少年型,严重程度依次递减。神(shén)经(jīng)专科医生一般根据(jù)患(huàn)者发(fā)病年龄、临床表现(xiàn)及病情进展程度进行临(lín)床(chuáng)诊断,辅助检查方法包括肌电图、肌酶和肌肉活检,结合家族(zú)史(shǐ)和SMN1基因分析可进行确诊。由于SMA患儿中约(yuē)94%为SMN1基因外(wài)显子(zǐ)纯合缺失,因(yīn)此,SMN1基因(yīn)缺(quē)失检测对于SMA的诊断具(jù)有更(gèng)高的灵敏(mǐn)度和特(tè)异性。且对不同型的SMA患者(zhě),SMN1纯合缺失率没有(yǒu)显著(zhe)差异,所(suǒ)以,SMN1纯合缺失的(de)检测对(duì)于不同型SMA患者(zhě)具有相同的临床诊断价值。在欧美人群中,SMN1基因纯合缺失检(jiǎn)测(cè)已(yǐ)成为(wéi)诊断(duàn)和排(pái)除诊断SMA的首选方法(fǎ)。

          SMN1基因缺失检测试剂的现状

          目前,SMN1基因外显(xiǎn)子(zǐ)缺失(shī)检测试剂较为(wéi)缺乏,临床检验实(shí)验室(shì)较为公认的方法是(shì)PCR结合限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法。但(dàn)该方法操作较(jiào)为(wéi)繁(fán)琐(suǒ),且重复性差,不利于标准(zhǔn)化,不易推广。同时,这种(zhǒng)方法只能检测出(chū)纯合缺(quē)失,无法确(què)认杂合(hé)缺失。

          荷兰的(de)SMAMLPA检测试剂可对待测靶序列进行半定量分(fèn)析,因此既可检测纯合缺失,亦可确认杂合缺失。在国内外(wài)已有多篇文献报道采用该方法进行SMA患(huàn)者诊断和SMA携(xié)带者筛查。但该产品目前仍为“仅用于(yú)研究”的试剂(jì),尚未按照体外诊断类(lèi)医疗器械(xiè)上(shàng)市(shì)(98/79/EC)。

          2015年底,原国家食品药品监管总局批准了第一项(xiàng)SMN1缺失突变检(jiǎn)测试剂上市。该(gāi)产(chǎn)品采用(yòng)多重实时(shí)荧光MGB-TaqMan探(tàn)针(zhēn)PCR法,以人基因组单(dān)拷贝基因RPP40为(wéi)内参(cān)基因,对SMN1基因第7外(wài)显子(zǐ)和第8外显子拷贝数(shù)进行相(xiàng)对定量(liàng)检测(cè),用于SMA患(huàn)者的体外辅助分子(zǐ)诊断。SMN1基因外显子(zǐ)缺失检测的难点之一在于排(pái)除高(gāo)同源(yuán)性基因SMN2的干(gàn)扰,特别是(shì)对于SMN2高拷(kǎo)贝数的(de)受试者,需(xū)保证(zhèng)结果的准确(què)可靠(kào)。该产品(pǐn)通过对实时荧光(guāng)PCR相(xiàng)对定量、绝对定量技术进(jìn)行系统整(zhěng)合,并(bìng)在反应体系中加入特(tè)定化学组分,以(yǐ)抑制PCR引物3’端(duān)的胞嘧(mì)啶(dìng)(C)与(yǔ)胸(xiōng)腺嘧(mì)啶(dìng)(T)的错配(pèi),增(zēng)加PCR扩增的特异性,从而(ér)有效控制SMN2基因非(fēi)特异性扩增(zēng)对检测结果的影响(xiǎng),准确检(jiǎn)出高拷贝数SMN2样本中SMN1基(jī)因第7和第8外显(xiǎn)子的缺失情况。

          鉴于国(guó)内外尚无(wú)任何(hé)按照(zhào)体(tǐ)外(wài)诊断试剂批准上市的(de)SMA分子诊断产品,因此临床试验方案中依据EMQN关(guān)于《SMA分子诊断最佳实践指南》,采(cǎi)用(yòng)了国内外SMA体外辅助分(fèn)子(zǐ)诊断领(lǐng)域公认的(de)PCR-RFLP法作(zuò)为对照方法。临床试验共完成1069例,其中正常对照组777例,SMA病例组292例,统计分析结果显示申报产(chǎn)品与对比方法检测结(jié)果的一(yī)致性为100%(95%置信区间:99.66%~100%)。此外,9747例正常成年人大样本中目标外显子△△Ct分布范围的调查亦显示,该产(chǎn)品(pǐn)的纯合突变判(pàn)断界(jiè)值(zhí)设置合理。

          该试剂目前批准(zhǔn)的预期用途仅(jǐn)包含纯合缺失的检测,尚不(bú)能用于杂(zá)合缺失的检测,因(yīn)此无法用于SMA携(xié)带者的筛(shāi)查,这是该产品的缺陷之一。

          事实上(shàng),该产品在设计上已考(kǎo)虑到SMA携带者的检测,其检测原理是以待(dài)测样(yàng)本中目标外显子荧光信号Ct值与内参基(jī)因荧(yíng)光信(xìn)号Ct值(zhí)之差(△Ct_s),与正常对照品(pǐn)三个梯度稀释品中目标外显子荧光信号Ct值和内参(cān)基因荧光信号Ct值之(zhī)差的平均值(zhí)(△Ct_a)之差,即△△Ct,作为(wéi)待(dài)测样本中目标外显(xiǎn)子拷(kǎo)贝数(shù)检测变量(△△Ct=△Ct_s-△Ct_a)。根据实(shí)时荧光定(dìng)量(liàng)PCR相对定量的基本数学原理推导(dǎo)得到(dào)申报(bào)产品检测变量△△Ct的计(jì)算公式,依据这一计算公式可推导出纯合缺失、杂合缺失和野生型的(de)△△Ct理论值(zhí)(或范围);再(zài)结(jié)合目标外(wài)显子与内参基(jī)因扩增(zēng)效率差异以及(jí)SMN2不(bú)同拷贝数的影响,可对上述(shù)△△Ct理论值(zhí)进行优(yōu)化(huà)。结果显示纯合缺失(shī)、杂合缺失和野生型的(de)△△Ct值(或范围)之间(jiān)可设置合理的判断界值,因此理论上该(gāi)产品可分别检测出三(sān)种基因状态。但鉴于生产企业(yè)对杂合缺失(shī)与(yǔ)野生型之间的判断界值研究尚不透(tòu)彻,再加上缺(quē)乏(fá)可判定杂合缺失的对比(bǐ)方法等其他困(kùn)难,本次注册申请(qǐng)的预期用途仅限于(yú)检测纯合突变,即SMA患(huàn)者辅助诊断(duàn)。

          综上,SMN1基因外显子缺(quē)失检(jiǎn)测在(zài)SMA疾(jí)病(bìng)诊(zhěn)断(duàn)和SMA携带者筛查中具有重要的(de)临床价值。然而(ér)到目前为止(zhǐ),受到技术水(shuǐ)平的(de)限制,相关的体外诊断试剂比较缺(quē)乏,特别是可用于SMA携带者筛查的杂合缺失(shī)检测,尚无适合的体外(wài)诊断(duàn)试剂上市。(器审中心审评(píng)六部  何静云)

        来源:中国医药报

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